Program Operational Sectorial "Cresterea Competitivitatii Economice"
"Investitii in viitorul dumneavoastra"

■ REZULTATE ETAPA a 13-a

1. Elaborarea tehnologiilor de fabricaţie a platformelor microfluidice
Activitatea 1.D.  Tehnologie de realizare a canalelor microfluidice prin metoda straturilor de sacrificiu

2. Testare experimentala
Activitatea 4.C. Elaborare experimentala: asamblarea containelor lipide in sisteme microfluidice - Metode de asamblare a lipozomilor in canale microfluidice prin focalizare hidrodinamica

*************

1. Elaborarea tehnologiilor de fabricaţie a platformelor microfluidice

Activitatea 1.D.  Tehnologie de realizare a canalelor microfluidice prin metoda straturilor de sacrificiu

Activitatea 1.D.3. Dezvoltarea tehnologiilor bazate pe oxid de siliciu ca strat de sacrificiu

Livrabil: -  Tehnologie de laborator pentru fabricarea microcanalelor prin tehnica de microprelucrare superficiala bazata pe polimeri ca straturi de sacrificiu

Au fost dezvoltate tehnologii de microprelucrare superficială bazate pe diverși polimeri folosiți ca strat de sacrificiu. Astfel, au fost dezvoltate tehnologii noi de realizare a canalelor microfluidice în PDMS, siliciu sau sticlă folosind ca strat de sacrificiu SU8 și au fost adaptate la aplicațiile microfluidice tehnicile preluate din microelectronică care folosesc ca strat de sacrificiu fotoreziști pozitivi sau negativi.

Metoda. Procedura de fabricație la care ne-am oprit este sintetizată în figura 1.
PDMSul este un elastomer, cunoscut pentru proprietățile sale de replicare. Rezoluția maximă ce poate fi obținută în cazul PDMS-ului este in jur de 100 nm. De asemenea, în vederea proiectării corecte a sistemelor microfluidice, trebuie luată în calcul contracția materialului care capătă un rol esențial în proiectarea și realizarea unor structuri (canale microfluidice) de bună calitate. În schema din figura 1 de mai jos se prezintă pașii tehnologici ai procesului de realizare a canalelor microfluidice în PDMS.

Figura 1:Procesul de fabricare a canalelor microfluidice in PDMS

Realizarea matritei de SU8 prin corodare umeda

SU8 este un fotorezist negativ gros din familia copolimerilor epoxi (sau poliepoxidelor), cu o bună rezistenţă mecanică, impermeabil, cu proprietăţi dielectrice după polimerizare. Datorită rezistenţei chimice și a biocompatibilităţii sale, SU8 este indicat în microfabricaţia sistemelor microfluidice, a microcanalelor și a dispozitivelor BioMEMS. Datorită rezistenţei sale chimice, SU8 nu poate fi îndepărtat usor. SU-8 este un polimer pe bază de raşină amplificat chimic cu sensitibitate excelentă şi raport de aspect foarte bun. Aplicaţiile principale se regăsesc în MEMS şi alte microsisteme, de exemplu: elemente microfluidice.

Pasii de procesare
Pasul 1: centrifugare; relaxare; tratament termic iniţial.
Pasul 2: expunere.
Pasul 3: tratament termic post-expunere.
Pasul 4: developare cu PGMEA (propilen glicol metal eter acetat); clatire cu alcool izopropilic; tratament termic final pentru întărire.

Descrierea procesului.

Realizarea matriței de SU8 prin corodare uscată

Se descriu experimentele realizate pentru corodarea SU8 în plasmă de O2/SF6 sau Ar/SF6. Este cunoscut faptul că plasma de oxigen îndepartează uşor materialele organice în general şi fotorezistii în special.

Prepararea probelor şi experimente

Toate experimentele s-au făcut pe sferturi de plachetă de 3’’ diametru, cărora li s-a păstrat oxidul nativ. SU8 a fost centrifugat pe plachete, in strat de grosime aproximativă 100mm, apoi au fost urmate procedurile standard.

Rezultate experimentale

Au fost realizate mai multe experimente de corodare SU8 în plasmă pentru a determina condițiile optime de proces specifice aplicațiilor microfluidice.

Prin analiza rezultatelor experimentale am determinat parametrii optimi pentru a coroda SU8 cu viteză mare, puţin peste 2mm/min.

Una din metodele dezvoltate recent pentru fabricarea microdispozitivelor fluidice este aşa numita litografie „moale”, bazată pe auto-asamblare sau replicare. Această metodă de microfabricaţie este convenabilă datorită performanţelor ridicate şi a costurilor scăzute, permiţând fabricarea unor dispozitive microfluidice. Rezoluţia metodei poate varia între 30nm şi 100μm, dar prin folosirea unor tehnici speciale s-a ajuns chiar şi la 6nm. Cele mai cunoscute tehnici de litografie moale sunt: transferul prin micro-contact (microcontact printing - μCP), replicarea prin turnare (replica molding - REM), micro-transferul prin turnare (microtransfer molding - μTM), micro-turnarea în capilare (micromolding in capillaries - MIMIC) şi micro-turnarea asistată de solvenţi (solvent-assisted micromolding - SAMIM).

Litografia moale prezintă câteva avantaje unice asupra altor forme de litografie:
-     costuri mici de fabricaţie pentru producţia în masă;
-     modelarea rapidă a unor arii mari;
-     biocompatibilitate;
-     transparenţă optică;
-     proprietăţi termice şi electrice acceptabile;
-     adecvată pentru aplicaţii pe suprafeţe non-planare;
-     nu necesită depuneri fotoreactive pentru prelucrare;
-     materialele pot fi funcţionalizate şi permit modificarea proprietăţilor suprafeţei.

Ca şi metodă pentru fabricarea microstructurilor pentru aplicaţii biologice, litografia moale lasă posibilitatea de a controla structura moleculară a suprafeţei şi de a imprima molecule complexe relevante pentru biologie, de a fabrica structuri de microcanale pentru fluidică şi de a imprima şi manipula celule. În special pentru experimente biologice, datorită dimensiunilor relativ mari ale celulelor, litografia moale poate fi folosită pentru fabricarea rapidă şi convenabilă a unor prototipuri ieftine.

Realizarea canalelor microfluidice în PDMS

Polidimetilsiloxanul este cel mai folosit polimer pentru litografie moale.  O ştampilă din PDMS poate fi fabricată prin depunerea pre-polimerului pe o plachetă de siliciu care conţine forma negativă a dispozitivului fabricat în PDMS. Folosind metodele clasice de litografie, placheta de siliciu este prelucrată şi tratată, după care se toarnă PDMS, se usucă si se îndepărtează. PDMS-ul astfel obţinut poate fi folosit în mai multe moduri pentru fabricarea structurilor dorite [2]. În afară de PDMS, pot fi folosiţi şi alţi elastomeri precum poliuretani, polimide şi răşini Novolac, dar PDMS-ul prezintă proprietăţi unice datorită scheletului anorganic de siloxan combinat cu prezenţa grupurilor metil organice ataşate siliciului. Principalele proprietăţi care recomandă PDMS-ul, în comparație cu alți polimeri, sunt:

• temperaturi de tranziţie scăzute, în stare fluidă la temperatura camerei;
• poate fi convertit în elastomeri prin polimerizare;
• este bine cunoscut, fiind foarte bine studiat şi documentat;
• prepolimerii şi agenţi de polimerizare sunt disponibili în comerţ;
• energia de interfaţă este scăzută şi prezintă stabilitate chimică foarte bună;
• nu este higroscopic şi nu se umflă datorită umidităţii;
• stabilitate termică foarte bună până la 180oC;
• transparent din punct de vedere optic până la grosimea de 300nm;
• este izotrop şi omogen.

Structură chimică  polidimetilsiloxan

Totuşi, în ciuda tuturor avantajelor prezentate, folosirea PDMS-ului sau a altor elastomeri prezintă obstacole tehnologice care trebuie depăşite pentru folosirea acestor materiale cu succes. Multe dintre problemele care pot să apară se pot rezolva direct prin proiectarea corectă a dispozitivului, păstrând anumite rapoarte între înălţime şi lăţime. Elasticitatea elastomerului este proprietatea principală care limitează raportul înălţime / lăţime. Dacă raportul înălţime / lăţime este prea mare, proprietăţile elastomerice vor duce la deformarea microstructurilor. În general, pentru PDMS, raportul înălţime / lăţime trebuie să fie între 0.2 şi 2 pentru a obţine mulaje fără defecte. În acelaşi timp trebuie avut în vedere că în urma degazării, PDMS-ul se contractă.
Fabricarea canalelor microfluidice în PDMS reprezintă o metodă simplă şi reproductibilă pentru testarea curgerii în canale microfluidice. Pentru facilitarea curgerii fluidelor în microcanale este necesară modificarea controlată a suprafeţelor acestora pentru a reduce unghiul de contact al fluidelor cu pereţii microcanalelor.

Tehnicile de funcţionalizare în plasmă a PDMS-ului sunt bine cunoscute şi au fost implementate în majoritatea laboratoarelor de cercetare în domeniu.
Folosirea acestui material pentru realizarea structurilor complexe este posibilă cu rezultate satisfăcătoare îndeosebi în cercetarea ştiinţifică. Tehnicile fotolitografice sunt folosite pentru realizarea microcanalelor în materialele polimerice, cum ar fi PDMS sau SU-8. Aceşti polimeri sunt folosiţi pentru fabricarea structurilor micro-electro-mecanice, MEMS, ei asigurând interfaţa dintre structura inertă şi componentele biologice ale unei structuri MEMS.

PDMS este un polimer flexibil, uşor de prelucrat şi destul de ieftin, ca preţ, motive suficiente pentru ca acesta să fie utilizat în sistemele microfluidice. PDMS este un elastomer transparent care poate fi depus pe o matriţă. Datorită transparenţei, el poate fi folosit pentru observarea tesuturilor, celulelor si altor materiale. De asemenea, PDMS este biocompatibil, motiv pentru care poate fi folosit pentru aplicaţii BioMEMS, fiind impermeabil faţă de soluţiile apoase.De asemenea, acest polimer poate fi prelucrat cu uşurinţă realizandu-se astfel structurile dorite.

Tehnici de litografie moale

Transferul prin micro-contact – μCP
Aceasta tehnică foloseşte modelul în relief de pe suprafaţa PDMS-ului pentru transferul prin imprimare a unui monostrat auto-asamblat prin contact pentru a alcătui microstructuri.
În general, monostraturile transferate au aproximativ 2-3nm şi pot fi folosite cu succes straturi de mascare în unele substaţe chimice corozive.

Replicarea prin turnare – REM
Replicarea prin turnare este o metodă eficientă pentru duplicarea formelor, morfologiilor şi structurilor de pe suprafaţa unei matriţe. Această tehnică este foarte puternică deoarece permite replicarea cu o rezoluţie foarte bună a structurilor tri-dimensionale foarte complexe. Este o tehnică simplă, fiabilă şi ieftină. Replicarea unei matriţe rigide este folosită în prezent pentru fabricarea în masă a reţelelor de difracţie, hologramelor şi micro-uneltelor. Procedura a fost extinsă şi la matriţe elastomerice, uşurând astfel procesul de desprindere a structurilor mici şi fragile.

Acurateţea tehnicii este dată în principal de interacţiile van der Waals, hidrofilitate şi factorii cinetici. Toate aceste interacţii fizice au rază mică de acţiune şi permit replicarea mult mai bună a dimensiunilor mici în comparaţie cu fotolitografia. În timpul polimerizării, comprimarea este mai mică de 3%, astfel rezultând structuri aproape identice cu negativul de pe matriţă.

Micro-transferul prin turnare – μTM
O matriţă este umplută cu prepolimer lichid. După îndepărtarea excesului de prepolimer, matriţa este pusă în contact cu substratul. Se face polimerizarea şi se îndepărtează matriţa.

Micro-turnarea în capilare – MIMIC
Această tehnică foloseşte fenomenul de curgere capilară. Matrița este pusă în contact cu suprafaţa substratului, astfel formându-se microcanale goale. Un prepolimer cu vâscozitate redusă este pus peste un orificiu de legătură cu microcanalele. Datorită fenomenului de curgere capilară, prepolimerul umple microcanalele goale, după care se produce polimerizarea. După îndepărtarea matriţei, pe suprafaţa substratului rămân structurile create. Structurile astfel formate sunt de obicei mai mici decât matriţa, dar au aceeaşi dimensiune laterală.

Fabricarea dispozitivului experimental

Dispozitivul experimental este alcătuit dintr-o serie de microcanale de intrare care se unesc într-un singur canal de ieşire.

Dispozitivul experimental a fost fabricat în PDMS prin tehnica REM. Întâi a fost fabricată matriţa şi apoi mulajul din PDMS, încapsularea fiind obţinută prin lipirea unei lamele de sticlă peste microcanale.

Au fost realizate două tipuri de dispozitive experimentale. Primul tip are o singură intrare pentru suspensia coloidală de lipozomi, iar al doilea tip are două intrări pentru suspensia coloidală de lipozomi. Au fost realizate canale test cu lăţimea de 20μm, 40μm şi 60 μm. Canalul principal de focalizare hidrodinamică are 19mm lungime, iar canalele de intrare au 4mm lungime.

Fabricarea matriţei
Matriţa a fost realizată printr-un proces standard de fotolitografiere folosind ca rezist SU-8.

Fabricarea mulajului
Pentru fabricarea mulajului s-a folosit PDMS de la Dow and Corning’s Sylgard 184. Acesta este un sistem cu două componente, siloxan şi agent de întărire.

Dezvoltarea tehnologiilor de sudare PDMS/Sticlă

După fabricarea mulajului, s-a folosit o lamă de bisturiu pentru obţinerea dispozitivele individuale fabricate în PDMS. 
Încapsularea dispozitivului s-a facut printr-o tehnică simplă şi eficientă..

După fabricarea unui microdispozitiv fluidic în PDMS este necesară încapsularea acestuia pentru a închide microcanalele realizate în PDMS, care altfel au o față deschisă. Având în vedere că în general, în cercetare, dispozitivele realizate în PDMS au partea inferioară destul de groasă, în ciuda transparenţei optice a acestuia este practic imposibilă vizualizarea curgerii prin microcanale prin partea inferioară a dispozitivului.

În general, sudarea sticlei se face în două moduri: folosirea unui adeziv pentru sudare reversibilă a sticlei de PDMS sau activarea în plasmă de oxigen pentru sudarea ireversibilă a sticlei de PDMS.

Funcţionalizarea materialelor polimerice. Hidrofilizarea Polidimetilsiloxanului în plasmă

Funcţionalizarea se referă la modificarea suprafeţei hidrofobe a polidimetilsiloxanului (PDMS) în suprafaţă hidrofilă, în special pentru aplicaţii microfluidice.

Procedura de lucru. Gradul de hidrofilie sau hidrofobie al probelor este măsurat cu ajutorul goniometrului înainte şi după funcţionalizare.

Desfăşurarea experimentului

Pentru fabricarea probelor de PDMS s-a folosit un kit SYLGARD 184 (Dow Corning), format din pre-polimer şi agent de întărire.

Concluzii.

A fost pezentat  fluxul tehnologic folosit pentru realizarea dispozitivelor in PDMS. Reţetele au fost testate în cadrul altor experimente şi am constat reproductibilitatea rezultatelor de funcţionalizare. Variaţii minore de la aceste rezultate pot să apară datorită curăţeniei suprafeţei PDMS-ului.

**********************

2. TESTARE EXPERIMENTALA

Activitatea 4.C - Elaborare experimentala: asamblarea containelor lipide in sisteme microfluidice - Metode de asamblare a lipozomilor in canale microfluidice prin focalizare hidrodinamica

Simulare numerică a obținerii lipozomilor prin focalizare hidrodinamică

Prin acest studiu, dorim să evidențiem comportamentul curgerii a două fluide imiscibile Newtoniene cunoscute (apa si ulei mineral) intr-o microbifurcație de tip „Y” cu două intrări și o ieșire. Principalul scop al studiului este determinarea geometriei optime a designului dispozitivului microfluidic. In această fază inițială s-a apelat doar la o investigare numerică a dinamicii fluidelor la interfață, manifestată pentru adâncimi diferite ale microcanalului.
Geometriile test sunt reprezentate prin două microcanale în formă de „Y”. Acestea prezintă două intrări separate pentru fiecare fluid și o ieșire.
Luând în considerare fenomenele prezentate mai sus, în această fază incipientă a studiului, putem conchide, pentru moment, că nu este recomandabilă folosirea unei adâncimi mai mari decât lățimea microcanalului, aceasta introducând efecte nedorite in dinamica curgerii.

Procedură experimentală pentru obținerea lipozomilor prin focalizare hidrodinamică

Reactivi.  Pentru obținerea structurilor lipidice veziculare s-au folosit următoarele tipuri de lipide: Fosfatidil colină (PC) (tip XVI-E), fosfatidil serina (PS), dioleoil fosfatidil etanolamina (DOPE), dipalmitoil fosfatidil etanolamină (DPPE), colesterol (Chol), colesteril hemisuccinat (CHEMS), stearilamină (SA) procurate de la firma Sigma Chemicals (St. Louis, Mo).

Tehnica folosită la prepararea lipozomilor. Această tehnică se bazează pe reluarea in solutie apoasă a unui film lipidic subtire, obținut in prealabil pe peretele unui balon de sticla in urma evaporarii totale a solventului organic (cloroform / metanol; 95:5), folosind un evaporator rotativ.

Proiectarea şi realizarea dispozitivelor microfluidice, așa cum a fost descrisă și în raportul științific și tehnic nr. 12.

Această etapă cuprinde:

• optimizarea design-ului și a proiectului măștilor fotolitografice,
• corodarea siliciului pentru crearea microcanalelor și a orificiilor de trecere prin tehnica de corodare uscată,
• decuparea structurilor de pe plachetele de siliciu și de sticlă,
• sudarea structurilor de siliciu și sticlă prin tehnica Anodic Bonding,
• lipirea porturilor microfluidice pentru accesul fluidic în microcanale.

Toate aceste etape enumerate mai sus și urmate în realizarea dispozitivelor microfluidice pe baza de siliciu, au fost descrise și detaliate în cadrul raportului precedent. În prezentul raport vom face referire doar la design-ul utilizat în realizarea microcanalelor pentru focalizarea hidrodinamic.

Montajul experimental utilizat în realizarea focusării hidrodinamice
Experimentul a fost realizat pe baza platformei Micro-PIV prin utilizarea concomitentă a sistemului de pompe microfluidice.

Desfășurarea experimentului

Experimentele detaliate mai jos au fost realizate pe un dispozitiv microfluidic cu trei intrări și secțiune transversală pătratică cu latura de 100 micrometrii. Au fost desfășurate un număr de patru experimente la diferite regimuri de curgere, respectiv diferențe de presiune. Curgerea soluției de lipozomi de pe canalul de mijloc, considerată și curgere principală (apă deionizată cu lipozomi), este îngustată/focalizată de curgerile laterale considerate curgeri secundare (alcool izopropilic). Lipozomii în starea lor inițială de la începutul experimentului se regăsesc într-o soluție apoasă

Concluzii.

În cadrul acestui capitol au fost descrise metodele experimentate pentru obţinerea și asamblarea lipozomilor în canale microfluidice prin focalizare hidrodinamică.
Mai întâi s-a studiat comportamentul reologic al soluţiei lipidice şi implicit a lipozomilor în contact cu solutiile buffer apoase. In acest sens s-a realizat o similitudine între interacţia lipozomilor cu soluţiile buffer şi interacţia între două fluide newtoniene imiscibile şi s-au realizat modelări numerice utilizând codul numeric comercial ANSYS FLUENT prin care s-a modelat obținerea unor picături similare cu lipozomii, controlând dimensiunile prin raportul debitelor.
În cadrul acestei etape s-au realizat cu succes primele dispozitive microfluidice pentru asamblarea formaţiunilor lipidice prin focalizare hidrodinamică. A fost realizat deasemenea, un montaj experimental folosind platforma Micro-PIV şi sistemul de micropompe pneumatice achiziţionat în cadrul proiectului. Software-ul pentru controlul pompelor microfluidice dezvoltat în cadrul etapelor anterioare a fost şi el utilizat şi testat.